6月5日，記者從中國科學院青島能源所獲悉，該所單細胞中心基于自主研制的RAGE(重力驅(qū)動單細胞液滴包裹拉曼分選)技術、儀器和相應試劑盒，首次實現(xiàn)了精確到一個細菌細胞、全基因組覆蓋度超過92%的環(huán)境菌群scRACS-Seq，為環(huán)境微生物組原位代謝功能研究提供了一個強有力的新工具。

單細胞拉曼分選耦合測序(RACS-Seq)是剖析環(huán)境菌群功能機制的重要手段，但拉曼分選后單個細菌細胞基因組的覆蓋度通常低于10%，極大限制了其應用。

土壤是地球上最重要的生態(tài)系統(tǒng)之一，土壤微生物組的代謝活動支撐著農(nóng)業(yè)與畜牧業(yè)，也在地球元素循環(huán)、全球氣候變化中起著關鍵性作用。同時，土壤菌群也是地球上最多樣與最復雜的微生物組之一，而其中大部分微生物尚難以培養(yǎng)，因此，單個細胞精度的拉曼分析-分選-測序(Single-cell RACS-Seq，簡稱scRACS-Seq)策略，是剖析土壤等環(huán)境菌群之代謝機制的重要手段。然而針對環(huán)境菌群的scRACS-Seq一直以來存在兩大瓶頸，一是難以無損、快速地獲取具有特定拉曼表型的單個細胞;二是難以獲得高覆蓋度的單細胞基因組數(shù)據(jù)。這已經(jīng)成為scRACS-Seq技術體系在復雜菌群中得以廣泛應用的關鍵瓶頸。

針對這一業(yè)界共性難點問題，該所單細胞中心荊曉艷、公衍海和徐騰等組成的聯(lián)合攻關小組，基于前期發(fā)明的RAGE-Seq技術(Raman-activated Gravity-driven Encapsulation and Sequencing; Xu, et al, Small, 2020)，從液相拉曼分析穩(wěn)定同位素底物飼喂的土壤菌群出發(fā)，將特定拉曼表型的細菌單細胞精準分離并包裹到皮升級液滴中，進而耦合下游基因組測序。結果表明：(i)土壤菌群中細胞代謝活躍的低豐度物種(如Corynebacterium spp., Clostridium spp., Moraxella spp., Pantoea spp. 和 Pseudomonas spp.等)可經(jīng)耦合重水飼喂與標記的RAGE-Seq精準地識別和分選，其單細胞基因組覆蓋率可高達近93%;(ii)同樣，基于RAGE-Seq，含類胡蘿卜素的土壤微生物細胞(如Pantoea spp., Legionella spp., Massilia spp., Pseudomonas spp., 和Pedobacter spp.等)能實現(xiàn)單個細胞分辨率、高基因組覆蓋度的代謝重建，從而完整、深入地挖掘其類胡蘿卜素合成途徑;(iii)這些“原位”合成類胡蘿卜素的土壤微生物細胞中，既有代謝活躍的，也相當部分是惰性的，表明基于純培養(yǎng)的策略勢必錯失這些代謝惰性的功能微生物，因此“原位”、單細胞精度的功能細胞識別和分離，對于全面、客觀的菌群功能剖析和資源挖掘具有重要意義。

據(jù)介紹，該工作還通過組分與狀態(tài)均精確可控的人工菌群，建立了系統(tǒng)且嚴格的scRACS-Seq質(zhì)量評價與控制體系?；谠擉w系，發(fā)現(xiàn)該技術能將不同拉曼表型的細菌單細胞從菌群中快速、精準分離，在保證單細胞拉曼光譜質(zhì)量的同時，分選準確性達100%。以來自于靶標細胞周圍水相的空液滴為陰性對照，發(fā)現(xiàn)靶標細胞序列中被菌群中其他細胞DNA污染的概率極低。上述工作定量證明了scRACS-Seq的靈敏度、特異性和可靠性。

作為RACS技術家族的新成員，scRACS-Seq可以在復雜菌群中以單個微生物細胞的分辨率建立新陳代謝與基因組的聯(lián)系，從而精確回答“誰在做什么，為什么”。在此基礎上，單細胞中心研制和產(chǎn)業(yè)化了單細胞拉曼分選-測序耦合系統(tǒng)(RACS-Seq儀器)，以及相應的RAGE芯片和單細胞分析試劑盒(包括環(huán)境樣品中微生物單細胞提取與制備、穩(wěn)定同位素飼喂細胞、單細胞核酸裂解與擴增等環(huán)節(jié))。該系統(tǒng)廣譜適用于細菌、古菌、真菌和動植物細胞，正服務于涵蓋各種復雜生態(tài)系統(tǒng)的研究和應用。

該工作由該所單細胞中心徐健研究員和馬波研究員主持，與中國科學院南京土壤研究所賈仲君研究員等合作完成。 (記者 王健高 通訊員 劉佳)